Entwicklung, Modellierung und Validierung von integrierten kontinuierlichen Gegenstrom-Chromatographie-Prozessen

Zobel-Roos, Steffen

Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung neuer, kontinuierlicher Chromatographieprozesse für den Einsatz bei der Aufreinigung biopharmazeutischer Produkte. Als typischer Vertreter dieser Gruppe wurde Immunglobulin G als Testsubstanz gewählt. Es sollten Prozesse basierend auf klassischer, partikulärer Chromatographie als auch membrangestützte Anwendungen untersucht werden. Für partikuläre Chromatographie wurde, ausgehend von der klassischen SMB, ein neues Verfahrenskonzept entwickelt. Dazu wurde zunächst eine Einsäulen SMB Analogie entworfen. Darauf aufbauend, und zur Ermöglichung von Gradiententrennungen, wurde die Einsäulen SMB zur integrated Counter Current Chromatographie weiterentwickelt. Diese kombiniert zwei Säulen mit unterschiedlichen Adsorbentien. Es werden stationäre Phasen verwendet, die mit gleichem Eluentensystem arbeiten. Der Gradient läuft dabei jedoch in entgegengesetzter Richtung. Dies ist zum Beispiel bei der Ionenaustausch- und der Hydrophoben Interaktionschromatographie der Fall. Auf Grund der großen Anzahl an Prozessmöglichkeiten und dem geringen Feed Bedarf wurde zur ersten Evaluierung ein modellbasierter Ansatz gewählt. Für die partikuläre Chromatographie wurde das bekannte General Rate Model implementiert und parametriert. Die Isothermen vom Typ competitive Langmuir wurden über Schüttelversuche bestimmt. Auftretende Probleme mit Produktdegeneration konnten über die Verwendung von Vergleichsproben minimiert werden. Die Modellvalidierung erfolgte getrennt in Fluiddynamik und Stofftransport inkl. Gleichgewicht. Für die Fluiddynamik wurde eine mittlere Abweichung der Verweilzeit zwischen Validierungsversuchen und Simulationen von weniger als 1 % festgestellt. Die Abweichung des gesamten Modells inkl. Stofftransport und Gleichgewicht beträgt ca. 3 %. Damit ist das Modell für die vorgesehene Anwendung hinreichend genau. Für die hier verwendeten Membranchromatographiemodule waren die bestehenden Modelle unzureichend. Es wurde daher ein neuer fluiddynamischer Ansatz gewählt. Die Validierung zeigte eine Abweichung bezogen auf die Fluiddynamik von weniger als 1 % bei insgesamt ca. 2,5 % Ungenauigkeit. Allerdings zeigten sich hier deutliche Ausreißer. Auf Grund des geringen Fehlers ist das Modell für die Prozessevaluierung verwendbar. Zur Prozessauslegung sollte die Fluiddynamik weiter untersucht werden. Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass das Moduldesign noch deutlich optimiert werden kann. Für die Einsäulen SMB wurde ein vereinfachtes Modell der Normalphasen Chromatographie verwendet. Dieses wurde mit einer Abweichung von weniger als 1 % validiert. Die Prozessbetrachtung der Einsäulen SMB begann mit der Auslegung eines klassischen SMB Prozesses mittels Dreieckstheorie. Es wurden Vergleichsstudien einer Viersäulen SMB sowie einer Einsäulen SMB mit Verweilzeitstrecken oder Zonentanks simuliert. Zwischen 4-SMB und 1-SMB mit Verweilzeitstrecken konnten kaum Unterschiede festgestellt werden. Beide erreichen 100 % Ausbeute und Reinheit sowie die gleiche Produktivität. Bei der Verwendung von Rührkesseln verschlechtert sich die Trennung jedoch. Grund dafür ist, dass die Konzentrationsprofile in den Tanks nicht erhalten bleiben. Eine der 4-SMB vergleichbare Trennung ist mit Rührkesseln als Zonentanks möglich, sofern ein Arbeitspunkt weiter entfernt vom optimalen Betriebspunkt gewählt wird. Grundsätzlich gilt das Konzept damit als valide und sollte experimentell überprüft werden. Die iCCC zeigte in Simulationsstudien eine bessere Leistung als ein vergleichbarer Batch-Lauf. Bei leicht besserer Reinheit können über 15 % Ausbeute (absolut) gewonnen werden. Zudem verdoppelt sich die Produktivität. In experimentellen Studien wird dieser Trend belegt. Hier konnte, relativ betrachtet, bis zu 50 % Ausbeute und 233 % Produktivität gewonnen werden. Weiterhin wurde der Eluentenverbrauch halbiert. Als problematisch erwies sich hier die Produktdegeneration. Zudem ist die Prozesssteuerung auf der eigentlich für die Batch Chromatographie ausgelegten Anlage problematisch. Die Stabilität des Prozesses wird maßgeblich von der Lage der Fraktionsschnittpunkte geprägt. Kontinuierliche Membranchromatographie basierend auf dem iCCC Konzept war mit den gegebenen Modulen und dem verwendeten Stoffsystem nicht möglich. Der Grund hierfür lag in extrem unsymmetrischen Peaks. Diese verhinderten sinnvolle Fraktionen zum Wiederbeladen in den folgenden Zyklen. Es wurden ähnliche Leistungsparameter wie für einen korrespondierenden Batch-Lauf ermittelt. Grundsätzlich wäre eine Änderung des Moduldesigns von Membranadsorbern anzustreben, um die Asymmetrie der Peaks zu minimieren. Für eine sequentielle Verschaltung waren, bei gleicher Ausbeute und Reinheit, eine bis zu 71 % höhere Produktivität im Vergleich zum Batch Prozess möglich. Der Eluentenverbrauch sank gleichzeitig um 38 %. Um Chromatographieprozesse automatisieren zu können wurde die Inline Concentration Measurement (ICM) entwickelt. Dabei handelt es sich um eine auf UV/VIS Daten basierende Spektralanalyse. Es wurden zwei unterschiedliche Methoden vorgestellt. Für Stoffe mit relativ unterschiedlichen UV/VIS Spektren eignet sich die Auswertung des Lambert-Beer’schen Gesetzes bei bekannten Extinktionskoeffizienten. Diese sind relativ einfach zu bestimmen. An einem Beispielsystem aus Chymotrypsinogen-A, Cytochrom-C und Lysozym auf einer Kationenaustausch-Säule wurde eine Genauigkeit der Methode von ca. 99,98 % ermittelt. Aus der offline Analytik bekannte Methoden zur Bestimmung des Proteingehalts lieferten im Vergleich Fehler zwischen 16,99 % und 21,27 %. Am Beispiel von IgG Monomer und Dimer wurde eine zweite Methode für Komponenten mit sehr ähnlichen UV/VIS Spektren vorgestellt. Das hierfür mittels SIMPLS-Algorithmus erstellte statistische Modell erreichte für dieses Testsystem ein Bestimmtheitsmaß von 0,98. Der „root mean square error of prediction“ (RMSEP) lag bei 0,13 mg/l für IgG Monomer und 0,019 mg/l für IgG Dimer. Auf Grund der geringen Berechnungszeit von weniger als 100 ms eignen sich beide Methoden zur Prozessautomatisierung. Ein Einsatz in der Chromatographie zur Fraktionierung des Produktes basierend auf inline ermittelten Reinheiten ist ebenso denkbar wie die vollständige Automatisierung kontinuierlicher Prozesse. Die Methodik ist weiterhin auch auf andere Grundoperationen übertragbar. Der ICM gesteuerte und automatisierte Betrieb der iCCC ist der nächste logische Schritt, der sich an diese Arbeit anschließen sollte. Im Hinblick auf „Smart Manufacturing“ Konzepte wäre weiterhin die Einbeziehung von Autosamplern zur selbstständigen Kalibrierung der ICM zu prüfen. In Kombination mit geeigneter Prozess Analyse Technologie für die vorhergehenden [Kornecki 2018] und nachfolgenden Schritte wäre die Entwicklung einer voll automatisierten Anlage zu prüfen.

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Zobel-Roos, Steffen: Entwicklung, Modellierung und Validierung von integrierten kontinuierlichen Gegenstrom-Chromatographie-Prozessen. 2018.

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