Methoden zur Integration von Upstream und Downstream Processing für Biologics hinsichtlich Prozessentwicklung, Digital Twin und Process Analytical Technology

Kornecki, Martin Lukas GND

Die hier präsentierte Integration von Upstream (USP) und Downstream Processing (DSP) zur Produktion von Biologics am Beispiel monoklonaler Antikörper evaluiert die Trennleistung des DSP anhand einer Charakterisierung der physikochemischen Eigenschaften der im DSP abzutrennenden Nebenkomponenten (NK). Während der Herstellung der rekombinanten Proteine mittels geeigneter Wirtszellen im USP werden eine hohe volumetrische Produktivität und Produktqualität entsprechend dem systematischen Ansatz der Prozessentwicklung Quality-by-Design (QbD) angestrebt. Hierbei sind erweiterte Prozesskontrollstrategien (engl. advanced process control, APC) im USP notwendig, um die für die Wirtszellen nötigen Umgebungsbedingungen zu schaffen, konstant zu halten und die zuvor im DSP definierten, kritischen NK zu minimieren. Digitale Prozessmodelle in Kombination mit der Process Analytical Technology (PAT) Initiative werden prozessunterstützend eingesetzt, um erweiterte Kontrollstrategien zu implementieren. Hierfür wurde die optische Dichte der Biosuspension bis zu einer Zellviabilität von 90 ± 2 % (bis 234 h Kultivierung) durch den Einsatz einer Trübungssonde mit der viablen Zellzahlkonzentration mit einem Bestimmtheitsmaß R2 von ≥ 0,98 korreliert. Die Anwendung der Raman-Spektroskopie in Kombination mit einer PLS-Regression führte zu einer Beschreibung der viablen Zellzahlkonzentration mit einem Bestimmtheitsmaß R2 von ≥ 0,95 und einem RMSE (root-mean-square error) von ≤ 13,82 ∙ 105 Zellen mL-1 über die vollständige Prozesszeit. Durch die Verwendung der Trübungssonde zum Betrieb von kontinuierlichen Kultivierungen wurde eine im Vergleich zum klassischen diskontinuierlichen Betrieb circa zweifach (2,1 ± 0,3) höhere volumetrische Produktivität erreicht. ATR-FTIR Spektren zeigten keine signifikanten Abweichungen in den Sekundärstrukturen des Proteins während der kontinuierlichen Kultivierung. Die Kombination der online gemessenen Trübungsdaten mit einem makroskopisch kinetischen digitalen Prozessmodell, welches auf der Monod-Kinetik basiert, führte zu einer Voraussage der offline gemessenen Glucose- (R2 ≥ 0,96) und Lactatkonzentration (R2 ≥ 0,90) während des diskontinuierlichen Betriebs der Kultivierung von Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen. Medienkomponenten und Prozessparameter im USP beeinflussen die Entstehung und Art der im DSP abzutrennenden NK. Hierfür wurden die physikochemischen Eigenschaften der NK und deren Abtrennbarkeit im Verlauf des DSP beschrieben, klassifiziert und quantitativ erfasst. Es wurde gezeigt, dass für den DSP unkritische NK, wie das Peroxiredoxin-6-ähnliche Protein, ein Molekulargewicht von < 30 kDa sowie einen isoelektrischen Punkt von < 6,90 und > 9,50 besaßen. Weniger kritische NK, wie die Pyruvatkinase, zeichneten sich durch ein Molekulargewicht von > 30 kDa als auch einen Bereich des isoelektrischen Punkts von 6,90 bis 7,30 und 9,30 bis 9,50 aus. Kritische NK, wie die Aldolase, hingegen besaßen ein Molekulargewicht von > 30 kDa und einen Bereich des isoelektrischen Punkts von 7,30 bis 9,30.

The integration of Upstream (USP) and Downstream Processing (DSP) for the production of biologics presented here, using monoclonal antibodies as an example, evaluates the separation performance of the DSP by characterizing the physicochemical properties of the side components (SC) to be separated in the DSP. During the production of the recombinant proteins by means of suitable host cells in the USP, a high volumetric productivity and product quality are aimed for in accordance with the systematic approach of Quality-by-Design (QbD) based process development. This requires advanced process control (APC) strategies in the USP to create and maintain the necessary environmental conditions for the host cells and to minimize the critical SC previously defined in the DSP. Digital process models in combination with the Process Analytical Technology (PAT) initiative are used to support the process in order to implement advanced process control strategies. For this purpose, the optical density of the biosuspension was correlated to the viable cell concentration up to a cell viability of 90 ± 2 % (up to 234 h cultivation) using a turbidity probe with a coefficient of determination R2 of ≥ 0.98. The application of Raman spectroscopy in combination with PLS regression led to a description of the viable cell concentration with a coefficient of determination R2 of ≥ 0.95 and a RMSE (root-mean-square error) of ≤ 13.82 ∙ 105 cells mL-1 over the entire process time. By using the turbidity probe for the operation of continuous cultivation, a volumetric productivity approximately two times (2.1 ± 0.3) higher than that of classical discontinuous operation was achieved. ATR-FTIR spectra did not show significant differences in the secondary structures of the protein during continuous cultivation. The combination of the online measured turbidity data with a macroscopic kinetic digital process model based on Monod kinetics resulted in a prediction of the offline measured glucose (R2 ≥ 0.96) and lactate concentration (R2 ≥ 0.90) during the discontinuous operation of the cultivation of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Media components and process parameters in the USP influence the origin and type of SC to be separated in the DSP. For this purpose, the physicochemical properties of the SC and their separability were described, classified, and quantitatively determined in the course of the DSP. It was shown that SC that were not critical for the DSP, such as the peroxiredoxin-6-like protein, possessed a molecular weight of < 30 kDa and an isoelectric point of < 6.90 and > 9.50. Less critical SC, such as the pyruvate kinase, were characterized by a molecular weight of > 30 kDa and an isoelectric point between 6.90 and 7.30 as well as 9.30 and 9.50. Critical SC, like the aldolase, on the other hand, had a molecular weight of > 30 kDa and an isoelectric point between 7.30 and 9.30.

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Kornecki, Martin: Methoden zur Integration von Upstream und Downstream Processing für Biologics hinsichtlich Prozessentwicklung, Digital Twin und Process Analytical Technology. Clausthal 2020.

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